Sviluppo di un biosensore QCM (Quartz Crystal Microbalance) per la determinazione dell'aflatossina B1 mediante un saggio sandwich aptamero-anticorpo

In recent years the use of aptamers in alternative to antibodies had a large development, an interesting application is constituted by their use as bioreceptors with analytical and diagnostic purposes and for the construction of biosensors. Aptamers are short oligonucleotide sequences in DNA or RNA, of variable length generally between 15 and 80 nucleotides, which bind with high affinity and specificity to a wide range of target molecules, such as proteins or other organic and inorganic molecules. Are generated by an in vitro selection process called SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). This technique combines the principles of combinatorial chemistry to molecular biology techniques, and allows to identify the specific DNA or RNA molecules of interest from a large population of oligomers in a random sequence. Aptamers offer many advantages compared to the proteins or to small drug molecules, therefore, have potential application in many fields of research and technology both as active elements, able to interfere with the biological machinery of cells and tissues, both as elements "labeling" for agents of various diagnostic and analytical interest because, if equipped with suitable linker, can be easily immobilized on the surfaces of biosensors or bio-chip with a density and a very high precision. A particular type of transducer used as biosensors scales microgravimetric (QCM, Quartz Crystal Microbalance), constituted by a thin disk of quartz fitted with two gold electrodes, one of which is functionalized so as to be sensitive to the presence of an analyte. Since the oscillation frequency of the quartz is proportional to the mass deposited on the electrode functionalized, such devices are able to provide qualitative and quantitative measures related to the presence / absence of an analyte [Tombelli, S. 2002]. The biosensor applications of aptamers range in very different fields, from bio-medical sector (diagnostic biosensors able to detect diseases and / or genetic predispositions quickly and at low cost) [Tang, J. et al., 2006], the environmental sector (biosensors capable of monitoring environmental pollution) [He, J. et al., 2011] to the agri-food sector (for the evaluation of the quality of the food, or for the detection of GMOs), [Castillo, G. et al., 2012]. Given the increasing interest around this branch of biotechnology, it has been possible to develop systems of measurement compact, portable, easy to use and of low cost.

Negli ultimi anni l’impiego degli aptameri in alternativa agli anticorpi ha avuto un largo sviluppo, un’interessante applicazione è costituita dal loro uso come biorecettori con finalità analitiche e diagnostiche e per la realizzazione di biosensori. Gli aptameri sono delle corte sequenze oligonucleotidiche a DNA o RNA, di lunghezza variabile generalmente fra 15 ed 80 nucleotidi, che legano con elevata affinità e specificità una vasta gamma di molecole bersaglio, quali proteine o altre molecole organiche e inorganiche. Sono generati da un processo di selezione in vitro chiamato SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment). Questa tecnica unisce i principi della chimica combinatoria a tecniche di biologia molecolare, e permette di identificare le specifiche molecole di RNA o DNA d’interesse partendo da una vasta popolazione di oligomeri a sequenza casuale. Gli aptameri offrono molti vantaggi rispetto alle proteine o alle piccole molecole farmacologiche, pertanto hanno un potenziale di applicazione in numerosi campi della ricerca e della tecnologia sia come elementi attivi, in grado di interferire con il macchinario biologico di cellule e tessuti, sia come elementi di ”etichettatura” per agenti di vario interesse analitico e diagnostico in quanto, se dotati di appropriati linker, possono essere facilmente immobilizzati sulle superfici dei biosensori o di biochip con una densità ed una precisione molto alte. Un particolare tipo di biosensori utilizza come trasduttore le bilance microgravimetriche (QCM, Quartz Crystal Microbalance), costituite da un sottile disco di quarzo munito di due elettrodi d’oro, uno dei quali funzionalizzato in modo da essere sensibile alla presenza di un analita. Dato che la frequenza di oscillazione del quarzo è proporzionale alla massa depositata sull’elettrodo funzionalizzato, tali dispositivi sono in grado di fornire misure qualitative e quantitative relative alla presenza/assenza di un analita [Tombelli, S. 2002]. Le applicazioni biosensoristiche degli aptameri spaziano in campi molto diversi: dal settore bio-medicale (biosensori diagnostici in grado di evidenziare malattie e/o predisposizioni genetiche in tempi brevi e a basso costo) [Tang, J. et al., 2006] al settore ambientale (biosensori in grado di monitorare inquinamenti ambientali) [He, J. et al., 2011] al settore agroalimentare (per la valutazione della qualità dei cibi, o per la ricerca di OGM), [Castillo, G. et al., 2012].Dato il crescente interesse attorno a questa branca della biotecnologie, è stato possibile poter sviluppare sistemi di misura compatti, portatili, di facile utilizzo e di basso costo.